Extraction of bioactive compounds from the leaves of Eucalyptus globulus using green solvents
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Eucalyptus globulus is a well-known source of phenolic compounds with many applications in the pharmaceutical, cosmetic, and food industries, being extensively found in Portuguese territory. Several studies have shown that the E. globulus extract contains important compounds for pharmacological and medicinal use with analgesic, antimicrobial, anti-inflammatory, antioxidant effects, among other applications. The use of its natural extracts has also been suggested as an alternative to synthetic drugs and additives, aiming to avoid possible undesirable side effects and prevent the development of resistance by microbiological organisms. The study of the matrix composition is essential to the development of new applications by obtaining bioactive compounds with high added value. In this work, the extraction of phenolic compounds from eucalyptus leaves was applied through heat-assisted and ultrasound-assisted techniques, using a green solvent (ethanol:water). Each extraction process was optimized using Response Surface Methodology (Traditional and Dynamic). The extraction time, solid/liquid ratio, the proportion of ethanol in the solvent, and temperature (or power, in the case of ultrasound-assisted extraction) were used as independent variables, and the extraction yield, phenolic acids, flavonoids, and total phenolic contents were the dependent variables. To support the development of new applications, bioactivity studies were carried out to evaluate the antioxidant, antimicrobial, anti-inflammatory and cytotoxicity activities of the extracts obtained under optimized conditions. Maximum antioxidant concentrations, between 5.95 to 6.85 μg/mL of dry extract, were determined by TBARS, expressed in terms of EC50. The antimicrobial activity was tested against several pathogens (Gram-positive and Gram-negative bacteria), demonstrating the ability to inhibit their growth. The highest antibacterial activity was obtained, with minimum inhibition concentration values of 0.6 mg/mL, for Yersinia enterocolitica and 0.3 mg/mL for Staphylococcus aureus. For the antifungal activity, Aspergillus fumigatus presented the highest sensibility. The anti-inflammatory activity was confirmed by inhibition of nitric oxide release in RAW 264.7 cells (murine macrophage). The extracts did not show cytotoxicity for the cell line tested (Vero cell line). The results obtained indicate that the extracts of E. globulus leaves have high bioactive capacity. Further studies should be conducted to verify the expected variability in the bioactive profile over time by collecting and analyzing periodically samples from the same region and under the same conditions.
O Eucalyptus globulus é uma árvore conhecida por ser uma fonte de compostos fenólicos com inúmeras aplicações na indústria farmacêutica, cosmética e alimentar, sendo extensivamente encontrada em território português. Diversos estudos têm demonstrado que o extrato de E. globulus contém compostos importantes para uso farmacológico e medicinal com efeitos analgésicos, antimicrobianos, antiinflamatórios, antioxidantes, entre outras aplicações. O uso de seus extratos naturais também tem sido sugerido como alternativa às drogas e aditivos sintéticos, visando evitar possíveis efeitos colaterais indesejáveis e prevenir o desenvolvimento de resistência por organismos microbiológicos. O estudo da composição da matriz é essencial para o desenvolvimento de novas aplicações a partir da obtenção de compostos bioativos de alto valor agregado. Neste trabalho, a extração de compostos fenólicos de folhas de eucalipto foi feita por meio de técnicas assistidas por calor e ultrassom, utilizando um solvente verde (etanol: água). Cada processo de extração foi otimizado usando duas estratégias de Metodologia de Superficie de Resposta (Tradicional e Dinâmica). O tempo de extração, a relação sólido/líquido, a proporção de etanol no solvente e a temperatura/potência foram usados como variáveis independentes, e o rendimento da extração, o teor de ácidos fenólicos, flavonóides e compostos fenólicos totais foram as variáveis dependentes. Os extratos foram caracterizados por análise de HPLC-DAD-ESI/MS para ácidos fenólicos e flavonóides, nos quais apresentaram alta concentração de galotaninos, flavonóides e derivados de ácidos fenólicos. Para apoiar o desenvolvimento de novas aplicações, foram realizados estudos de bioatividade a fim de avaliar as atividades antioxidante, antimicrobiana, anti-inflamatória e citotoxicidade dos extratos obtidos em condições otimizadas. Concentrações máximas de antioxidantes, entre 5.95 a 6.85 μg/mL de extrato seco, foram determinadas por TBARS, expressas em termos de EC50. A atividade antimicrobiana foi testada contra vários patógenos (bactérias Gram-positivas e Gram-negativas), demonstrando capacidade de inibir seu crescimento. A maior atividade antimicrobiana foi obtida, com valores de MIC de 0.6 mg/mL, para Yersinia enterocolitica e 0.3 mg/mL para Staphylococcus aureus. Para atividade antifúngica, Aspergillus fumigatus apresentou maior sensibilidade. A atividade anti-inflamatória foi confirmada pela inibição da liberação de óxido nítrico em células RAW 264.7 (macrófago de camundongo). Os extratos não apresentaram citoxicidade para a linhagem celular testada (linha celular Vero). Os resultados obtidos indicam que os extratos de folhas de E. globulus apresentam boa capacidade bioativa. Novos estudos devem ser realizados para verificar a variabilidade esperada no perfil bioativo ao longo do tempo, por meio da coleta e análise periódica de amostras da mesma região e nas mesmas condições.
