Num cenário de declínio de diversidade genética a nível mundial, estamos cientes da
necessidade de preservar as raças autóctones portuguesas.
Com este estudo pretendemos fazer face à ausência de caracterização da estrutura e
das possíveis relações genéticas entre as diferentes raças autóctones caprinas portuguesas.
Assim, na revisão bibliográfica procurou-se dar ênfase às possíveis causas e aos efeitos da
erosão genética que se vem operando ao longo dos tempos. Por outro lado, deu-se
importância ao género Capra, particularizando aspectos relativos às raças autóctones
caprinas portuguesas, tais como: caracterização morfológica, distribuição geográfica de
origem e principais aptidões. Os dois últimos capítulos foram dedicados às diferentes
metodologias laboratoriais e estatísticas disponíveis e necessárias para levar a cabo o
trabalho experimental.
Foram recolhidas amostras de sangue de cinco raças autóctones portuguesas (Bravia,
Serrana, Charnequeira, Serpentina e Algarvia) e respectivos ecótipos, para além de duas
raças exóticas (Saanen e Alpina) que serviram como termo de comparação. A extracção de
DNA foi realizada pelo método de MILLER et al. (1988). Após a escolha de 23
microssatélites, a sua amplificação foi realizada através da técnica de Polimerase Chain
Reaction (PCR), utilizando um termociclador. A identificação dos alelos dos marcadores
microssatélicos realizou-se mediante electroforese vertical em gel de poliacrilamida, em
condições desnaturantes. Os marcadores foram analisados num sequenciador automatizado
ALF Express R DNA Sequencer, utilizando-se para posterior análise genotípica o programa
Allele Links. As frequências génicas foram calculadas através de contagem directa, o
equilíbrio de Hardy-Weinberg foi estimado usando o programa GENETIX 4.02 (BELKHIR,
2000) e os desvios comparados segundo o Exact Test (GUO e THOMPSON, 1992).
utilizando o programa GENEPOP 1.2 (RAYMOND e ROUSSET, 1995). A heterozigotia foi
calculada segundo NEI (1987). A análise de componentes principais foi realizada
recorrendo-se ao programa STATISTICA para Windows 5.1. Por fim, as distâncias genéticas
e os dendrogramas foram obtidos usando o programa NJBAFD (TAKEZAKI, 1997).
Neste estudo foi possível estabelecer um conjunto de microssatélites que podem ser
amplificados em multiplex e que se revelaram apropriados à realização de estudos
populacionais, podendo no futuro serem utilizados em várias vertentes da conservação de
raças caprinas.
viii
A variabilidade encontrada entre as raças autóctones caprinas portuguesas foi
semelhante e, em alguns casos, superior mesmo à encontrada entre raças autóctones de
outros países. A análise de componentes principais, assim como as distâncias utilizadas,
revelaram um afastamento das raças Bravia e Algarvia relativamente ao conjunto formado
pela Serpentina, pela Charnequeira e pela Serrana. Por outro lado, observou-se um
afastamento nítido entre as raças Bravia e Algarvia. A análise dos dendrogramas revelou
algumas diferenças relativamente à metodologia multivariante, nomeadamente uma
imprecisão no posicionamento das raças Bravia e Serrana e uma proximidade entre as
raças Bravia e Charnequeira. Neste tipo de análise, os ecótipos da raça Serrana mostraramse
mais próximos. Por fim, verificou-se uma proximidade entre as raças Algarvia e
Serpentina.
Embora se verifique a necessidade de utilizar modelos matemáticos que se ajustem
melhor ao comportamento dos microssatélites, estes marcadores moleculares revelaram
ser, até ao momento actual, os mais apropriados a estudos de variabilidade genética e de
relações populacionais. En el presente estudio se ha realizado un análisis de las relaciones genéticas entre
razas autóctonas de ganado caprino portugués utilizando marcadores de tipo microsatélite.
En la Revisión bibliográfica se hace especial hincapié en las posibles causas y los efectos
de la erosión genética que viene actuando en los últimos años. Por otro lado, se realizó una
revisión sobre el origen de los diferentes grupos del género Capra, particularizando en los
aspectos relativos a las razas autóctonas caprinas portuguesas, tales como la
caracterización morfológica, la distribución geográfica, el origen y sus principales
aptitudes. Los dos últimos capítulos se dedicaron a las distintas metodologías laboratoriales
y estadísticas disponibles y necesarias para llevar a cabo el trabajo experimental.
Para la realización de esta Tesis, se recogieron muestras de sangre de cinco razas
autóctonas portuguesas (Bravia, Serrana, Charnequeira, Serpentina y Algarvía) con sus
respectivos ecotipos, además de dos razas foráneas (Saanen y Alpina) que se utilizaron
como poblaciones de referencia. La extracción del DNA se llevó a cabo por el método de
MILLER et al. (1998). Se analizaron 23 marcadores de tipo microsatélite mediante
amplificación por la técnica de Reacción en cadena mediante la polimerasa (PCR)
utilizando un termociclador. La identificación de los alelos de los marcadores
microsatélites se realizó mediante electroforesis vertical en geles de poliacrilamida en
condiciones desnaturalizantes utilizando para ello un secuenciador automático y el
programa del análisis Allele Links. Se utilizó el programa GENETIX 4.02 (BELKHIR, 2000)
para el cálculo de las frecuencias génicas y la heterocigosis. La adecuación de las
poblaciones al equilibrio Hardy-Weinberg se estimó utilizando el test exacto propuesto por
GUO y THOMPSON (1992) mediante el programa GENEPOP 1.2 (RAYMOND y ROUSSET,
1995). Las distancias genéticas y los dendrogramas se obtuvieron con el programa
NJBAFD (TAKEZAKI, 1997) y el análisis de componentes principales y la clasificación
poblacional con el paquete estadístico STATISTICA para Windows 5.1
En la presente memoria se obtuvo un conjunto de microsatélites que pueden ser
amplificados de forma conjunta (multiplex) y que se muestran como muy útiles para la
realización de estudios poblacionales, pudiendo en un futuro utilizarlos en diferentes
aspectos de la conservación de las razas caprinas.
La variabilidad encontrada en las razas caprinas autóctonas portuguesas fue similar, e
incluso superior, a la que presentan las poblaciones de cabras de otros países. El análisis de
componentes principales puso de manifiesto una separación de las razas Bravía y Algarvía
x
con respecto al bloque formado por Serpentina, Charnequeira y Serrana. Por otro lado, se
observó una separación muy clara entre las poblaciones de Bravía y Algarvía. El análisis
de los dendrogramas obtenidos a partir de las distancias genéticas estimadas puso de
manifiesto un posicionamiento poco definido de las razas Serrana y Bravía, una relativa
proximidad entre las razas Algarvía y Serpentina así como una clara proximidad de las
razas Bravía y Charnequeira. En este tipo de análisis los ecotipos de la raza Serrana se
mostraron muy próximos entre sí.
Aunque se deben desarrollar modelos matemáticos que se ajusten mejor a los
comportamientos mutacionales de los microsatélites, estos marcadores moleculares son,
hasta el momento actual los más apropiados para los estudios de variabilidad genética y de
relaciones poblacionales. While biodiversity is decreasing worldwide we are aware of the need to preserve
Portuguese autochthonous breeds.
This study aims to face the lack of structural characterization and possible genetics
relationships between the different Portuguese autochthonous goat breeds. The
bibliographic review focused on possible causes and effects of the genetic erosion taking
place throughout time. An especially emphasis was paid to genre Capra, particularly to
Portuguese autochthonous breeds features as morphological characterization, geographic
area of origin and production performances. Lab and statistical methodologies necessaries
to experimental work were reviewed on the last two chapters.
Blood samples were collected from five Portuguese autochthonous breeds – Bravia,
Serrana, Charnequeira, Serpentina and Algarvia – and respective ecotypes and two exotic
breeds – Saanen and Alpina – for comparative purposes. DNA extraction was preformed
according to MILLER et al. (1988) protocol. After selecting 23 microsatellites they were
amplified by the Polimerase Chain Reaction (PCR) technique using a termocyclator.
Microsatellites markers alleles were identified by poliacrilamide gel vertical
electrophoresis under denatured conditions. Markers were assayed on an automatic
sequencer and genotype analysis performed using the ALLELE LINKS program. Genomic
frequencies were calculated by direct count, Hardy-Weinberg equilibrium (EHW)
estimated using the GENETIX 4.02 program (BELKHIR, 2000) and deviations analysis
accomplished using the Exact Test (GUO and THOMPSON, 1992) of the GENOPOP 1.2
program (RAYMOND and ROUSSET, 1995). Heterozigosity was calculated according to
NEI (1987). Main components analysis was performed using the STATISTICA program for
Windows 5.1. At last genetic distances and dendrograms were achieved using the NJBAFD
program (TAKEZAKI, 1997).
A conjugation of microsattelites that could be amplified as multiplex was established
on this study. It seemed appropriated to study population and it may be used on different
aspects of goat breeds conservation in the future.
Portuguese autochthonous goat breeds variability was identical or even higher than
those found among other breeds in other countries. Main components analysis as genetic
distances used showed a detachment between Bravia and Algarvia breeds and Serpentina,
Charnequeira and Serrana set of breeds. A clear detachment between Bravia and Algarvia
breeds was also found. Dendrogram analysis showed some diferences toward
xii
multivariance methodology, resulting in an imprecise positioning of Bravia and Serrana
breeds and in Bravia and Charnequeira breeds’ vicinity. Serrana ecotypes seemed closer
under this analysis. Finally proximity between Algarvia and Serpentina breeds was
identified.
Although it is necessary to use mathematic models more adjusted to microsatellites
conduct, these molecular markers are presently the most appropriated to study genetic
variability and population relationships.
PRODEP II, Acção 5.2- Formação avançada no Ensino superior, Concurso de 1/96. Universidade de León - Espanha. Universidade de Trás-os-Montes e Alto Douro.
